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单抗导向的超抗原联合细胞因子基因治疗的抗肿瘤作用及其免疫机理 论文题目：单抗导向的超抗原联合细胞因子基因治疗的抗肿瘤作用及其免疫机理研究 作者简介：王青青，女，1971年12月出生，1997年09月师从于浙江大学余海教授和曹雪涛教授，于2001年06月获博士学位。 休 闲 居 编 辑 摘 要 目前研究表明，肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的可能原因包括肿瘤的抗原调变和异质性、瘤细胞的MHC抗原和共刺激分子表达不足、APC功能缺陷、局部细胞因子缺乏以及游离的免疫抑制性细胞或分子在局部浓聚等，这多种因素最终造成肿瘤局部处于深度的免疫抑制状态，免疫效应细胞在数量和质量上都不足以激发起有效的抗肿瘤免疫应答。因此，试图逆转肿瘤局部的免疫抑制状态，增强原先呈低下状态的肿瘤免疫原性，提高局部活化的免疫效应细胞的数量，以激发起强烈的抗肿瘤免疫反应，可能是机体得以排斥肿瘤的有效手段，这也是目前肿瘤免疫（生物）治疗的一个主要目的。 在寻找有效的淋巴细胞激活剂用于抗肿瘤的研究中，超抗原以其强烈激活T淋巴细胞的特性而备受关注。超抗原是一类特殊的抗原分子，主要是一些细菌的毒素和逆转录病毒基因的产物，不需要抗原提呈细胞(APC)的加工处理，而以完整的蛋白质形式直接与细胞膜上的MHC II类分子结合形成复合物，识别TCR的Vb片段，激活比普通抗原多得多的T细胞（包括CD4+，CD8+），并释放大量细胞因子，对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用，这种作用被称为超抗原依赖细胞介导的细胞毒作用 ( Superantigen-dependent cell-mediated cytotoxicity, SDCC)。超抗原与人类多种急、慢性疾病的发生有关，但在抗肿瘤研究中也发挥了独特的作用，尝试用它激活的T细胞来杀伤肿瘤，并取得了一定的成果，目前较有研究基础的超抗原主要是金黄色葡萄球菌肠毒素A、B（SEA、SEB）等。但超抗原直接用于抗肿瘤有很多的限制，因为它无抗肿瘤的特异性，大多数肿瘤都不表达MHC II类抗原，而且MHC II类阳性的APC也能成为超抗原的靶细胞被杀伤而导致严重的副作用。为了增强其对肿瘤的特异性，Kalland等用基因工程的方法构建了抗人大肠癌相关抗原(C215,C242)的单抗Fab段与超抗原SEA的融合蛋白（C215Fab-SEA，C242Fab-SEA），实验证明这种融合蛋白对MHC II类分子的亲和力不及SEA的1/1000，使SEA对MHCII类抗原的依赖性大大降低，不再需要MHC II类分子的辅助，而通过单抗与表达相应抗原的肿瘤细胞特异性结合后，在肿瘤局部活化大量T细胞，释放多种细胞因子，成为“单抗导向的超抗原”。其抗肿瘤作用主要包括两个方面：①T细胞的直接杀伤作用：CD8＋ CTL通过分泌穿孔素（Perforin）对肿瘤细胞发挥强烈杀伤作用。②细胞因子的直接和间接作用：超抗原激活T细胞抗肿瘤过程中释放多种足量的细胞因子，研究表明Th1型细胞因子IFN－g，IL－2等起着主要作用，这些因子可直接杀伤肿瘤细胞或促进肿瘤细胞的MHC分子和粘附分子的表达，并能增强NK细胞的杀伤力以及促进炎症反应等。 尽管单抗与超抗原的融合蛋白在体内和体外实验中都显示出一定的抑瘤效果，可能是一个有潜在应用价值的肿瘤生物治疗剂，但在其应用中还存在着许多问题：（1）融合蛋白的疗效还有待于进一步提高，它活化的T细胞是SEA反应性的，并不是肿瘤特异性的T细胞，其诱导的抗肿瘤免疫应答并不尽如人意，因此如何增强抗肿瘤免疫反应，提高融合蛋白的疗效，是具有重要意义的问题。（2）并非所有的肿瘤都表达C215，C242抗原，该融合蛋白缺乏抗瘤的广谱性。（3）动物实验中，观察反复使用融合蛋白后，Th1型细胞因子IFN－g，IL－2的水平下降，CTL的数量和活性均降低，表明融合蛋白易导致肿瘤局部的免疫耐受和抑制，其原因可能是T细胞被SEA大量激活后转入无能（Anergy）状态及随后发生凋亡，出现了免疫耗竭（exhaustion）。文献报告，Rosendahl将融合蛋白C215Fab-SEA与Fab-IL-2联合使用，其效果比两者单用的效果都好，肿瘤局部浸润的活化T细胞增多，肿瘤抑制性的细胞因子水平提高，CTL活性增强。 针对目前单抗导向的超抗原治疗存在的问题，本课题旨在研究用新的免疫基因治疗提高超抗原抗肿瘤的效果并探讨其机理。本研究用人大肠癌相关抗原C215的基因转染小鼠B16细胞建立表达C215抗原的小鼠黑色素瘤模型，研究腺病毒载体介导的细胞因子基因治疗（白细胞介素18和趋化因子lymphotactin）联合单克隆抗体导向的超抗原C215Fab-SEA的免疫治疗的抗肿瘤作用并观察其免疫指标的改变，以期进一步提高融合蛋白的抑瘤效应。白细胞介素18（IL－18）作为一种新型细胞因子，可强烈诱导Th1细胞因子（IFN－g，IL-2，GM－CSF等）的产生，激活NK细胞，刺激T细胞增殖和增强CTL的活性，对于融合蛋白持续应用后出现的Th1细胞因子水平下降和CTL反应低下可能起到一个较好的平衡作用，可维持局部有效的细胞因子水平，阻止融合蛋白治疗后的免疫抑制的发生，从而有效促进融合蛋白的抗肿瘤作用。另一方面，肿瘤局部能被激活的T细胞数量有限，消耗后造成数量减少和活性减低，而lymphotactin（Lptn）是近年来新发现的C趋化因子，它在肿瘤局部的持续表达可使NK、T细胞等细胞大量趋化到肿瘤部位，这些新鲜补充的高反应性的免疫效应细胞又可被SEA激活，激发起强烈的特异性和非特异性抗肿瘤免疫应答，杀伤残留的肿瘤细胞，对融合蛋白的抑瘤作用可能有增强效应。 本研究的目的在于：（1）观察腺病毒介导的IL－18基因疗法联合C215Fab- SEA的抗肿瘤作用及其免疫机理探讨。（2）研究C215抗原转染的瘤苗及转染了IL-18基因并结合了C215Fab-SEA的瘤苗对肿瘤的治疗作用和免疫保护作用。（3）研究腺病毒介导的Lptn基因治疗联合C215Fab-SEA对肿瘤的治疗作用及其免疫机理。 本研究分四部分： 第一部分：建立表达C215抗原的小鼠黑色素瘤模型。 真核表达质粒pKGE839含有GA 733-2 cDNA（编码C215抗原）和新霉素抗性基因，经Lipofectamine方法转染到B16细胞系，经G418（800mg/ml）抗性筛选得到阳性克隆（B16-C215）。用抗C215单抗和FITC标记的二抗标记细胞后，FACS检测转染后细胞表面C215抗原的表达，结果表明转染后的细胞表面C215抗原呈阳性表达，在整个实验过程中B16-C215表达稳定。接种至小鼠形成的肿瘤结节制备成细胞悬液，FACS检测其表面C215抗原亦呈阳性，表明该动物模型稳定可靠，且B16细胞转染C215抗原后其致瘤性无明显变化，肿瘤生长曲线与野生型B16细胞相似。
第二部分：C215Fab-SEA联合腺病毒介导的IL－18基因治疗对肿瘤的治疗作用及其免疫机理探讨。 白细胞介素18（IL－18）是近年来发现的新型细胞因子，具有多种重要的生物学功能包括强烈诱生IFN-g，激活NK细胞，刺激T细胞增殖和增强淋巴细胞的细胞毒作用，诱导Th1细胞产生细胞因子。在本研究中，我们首次将腺病毒载体介导的IL-18疗法与Fab-SEA联合应用于肿瘤的免疫治疗。为了观察C215Fab-SEA联合Ad IL－18对荷瘤小鼠的治疗作用，给6~8周龄C57BL/6小鼠后腿皮下接种105的B16-215细胞，3天后将小鼠随机分为7组，分别给予PBS（空白对照），AdLacZ(空白病毒对照)，C242Fab-SEA（无关抗体对照），C215Fab-SEA，AdLacZ/C215Fab-SEA，AdIL-18和AdIL-18/C215Fab-SEA治疗。接种后第3天瘤体内注射108 PFU / 0.1ml病毒，8天后重复一次，第4天起瘤体内注射C215Fab-SEA 15mg / animal，隔天一次，共4次，观察并记录肿瘤生长情况。治疗结束后5天，每组取3只小鼠，取瘤体组织做常规病理检查，取脾脏淋巴细胞检测NK活性，用灭活肿瘤细胞诱导7天后测其CTL活性，并以ELISA法测定脾脏淋巴细胞在灭活肿瘤细胞刺激下细胞因子（IL-2、IFN-g、IL-4、IL-10）的分泌水平，每组留5只小鼠观察存活情况。结果表明，四个治疗组小鼠皮下肿瘤结节明显小于3个对照组，C215Fab-SEA治疗组肿瘤小于AdIL-18治疗组，而其中联合治疗组小鼠的肿瘤生长又明显小于单用AdIL-18或C215Fab-SEA组。联合治疗组有40%的小鼠长期存活，而单用C215Fab-SEA治疗组20%的小鼠无瘤生存。联合治疗组小鼠瘤体内和肿瘤周围有大量的炎性细胞浸润，浸润程度高于单用AdIL-18或C215Fab-SEA处理组。联合组的小鼠脾脏NK活性和CTL活性都明显高于其他组。细胞因子的检测结果表明，四个治疗组脾细胞分泌的IL-2，IFN-g的水平高于对照组，而联合治疗组的IL-2，IFN-g水平明显高于其他治疗组。以上结果表明，IL-18联合C215Fab-SEA免疫治疗不但提高了非特异性抗肿瘤应答，增强NK细胞的抗肿瘤作用，而且激发起机体的特异性抗肿瘤免疫，提高了CTL活性，比单独应用Ad IL-18或C215Fab-SEA具有更强大的抗肿瘤作用，Th1型细胞因子IL-2和IFN-g在其抗肿瘤过程中起着重要作用。 为了进一步研究Th1，Th2型细胞因子在融合蛋白治疗中所起的作用，我们还观察了C215Fab-SEA联合IL－18基因治疗对IL-10基因敲除（knock out，KO）小鼠（C57BL/6）的抗肿瘤作用，结果表明C215Fab-SEA对IL-10 KO小鼠的肿瘤抑制作用明显强于对正常C57BL/6小鼠的作用，而C215Fab-SEA联合AdIL-18治疗对荷瘤的IL-10 KO小鼠更达到了理想的效果，所有的小鼠都无瘤生存。这表明IL-10在Fab-SEA介导的肿瘤免疫治疗中起着负向的调控作用，IL-10的产生限制了融合蛋白抑瘤作用的发挥。 为进一步探讨C215Fab-SEA联合腺病毒介导的IL－18基因疗法的抗肿瘤过程中可能参与的机制，我们在体外建立各种不同的细胞培养体系，用Ad IL-18转染的B16-C215与C57BL/6小鼠脾脏分离的淋巴细胞共育，同时用C215Fab-SEA（10mg/ml）刺激，并设各种相关对照。结果发现，与Ad IL-18转染的B16-C215共育的淋巴细胞经C215Fab-SEA处理后，其增殖活性明显增强，CD4+及CD8+T细胞的比例增高，而且B16-C215肿瘤细胞表面的MHC I类分子（H-2Kb）以及Fas分子的表达明显上调。这些结果提示Ad IL-18联合C215Fab-SEA治疗作用的参与机制包括强烈刺激淋巴细胞的增殖，增强肿瘤细胞的免疫原性，CD4+ 和CD8+ T细胞亚群都得到有效扩增发挥各自的作用。
第三部分：C215Fab-SEA联合腺病毒介导的lymphotactin基因治疗的抗肿瘤作用及其免疫机理。 肿瘤局部能被激活的T细胞数量有限，消耗后造成数量减少和活性减低。lymphotactin（Lptn）作为一种新型趋化因子，可特异性地趋化NK、T细胞，用腺病毒载体将Lptn基因转染至肿瘤组织，Lptn的持续表达可使高反应性的免疫效应细胞大量趋化到肿瘤部位，激发起有效的抗肿瘤免疫。我们尝试用腺病毒介导的Lptn基因疗法来增强融合蛋白Fab-SEA的抗肿瘤作用并初步探讨其机理。6~8周龄C57BL/6小鼠后腿皮下接种105的B16-215细胞，3天后将小鼠随机分为7组，分别为PBS（空白对照），AdLacZ(病毒对照)，C242Fab-SEA（无关抗体对照），C215Fab-SEA，AdLacZ/C215Fab-SEA，Ad Lptn，AdLptn/C215Fab-SEA治疗组。荷瘤后第3天瘤体内注射108PFU/0.1ml病毒，8天后加强一次，荷瘤后第4天起瘤体内注射C215Fab-SEA 15mg/animal，隔天一次 ´ 4次。治疗结束后5天，每组取3只小鼠，取瘤体组织做常规病理检查，取脾脏淋巴细胞检测NK活性，与灭活的B16-C215共培养7天后用4-h51Cr释放试验检测CTL活性。结果发现，与3个对照组相比，单独应用C215Fab-SEA或AdLptn治疗组小鼠肿瘤生长受到一定抑制，而AdLptn/C215Fab-SEA联合治疗对荷瘤小鼠的治疗最为有效，联合治疗组有50%的小鼠无瘤生存，而单用C215Fab-SEA或AdLptn治疗组可见有20%的小鼠长期存活。瘤体的常规病理检查提示，与单用AdLptn或C215Fab-SEA处理组相比，联合组小鼠瘤体内和肿瘤周围有大量的炎性细胞浸润。细胞杀伤实验的结果表明，用C215Fab-SEA或AdLptn处理组小鼠脾细胞的NK活性较高，表明NK细胞参与了抗肿瘤作用，联合治疗组小鼠的脾脏NK活性更高于其他组。与其他治疗组比较，联合组小鼠脾细胞可被诱导出较高的CTL活性。 以上结果表明，在应用C215Fab-SEA免疫治疗的同时联合腺病毒介导的Lptn基因疗法能增加肿瘤区免疫效应细胞的浸润，激发起机体的特异性抗肿瘤免疫应答以及非特异性的杀伤作用，提高CTL活性，有效地强化了Fab-SEA融合蛋白的抗肿瘤作用，使肿瘤生长得到明显的控制。
第四部分：C215Fab-SEA联合C215抗原基因转染的瘤苗的抗肿瘤效应，转染了IL-18基因并结合C215Fab-SEA的瘤苗对肿瘤的免疫保护作用。 近年来，抗肿瘤疫苗的研究发展迅速，从肿瘤细胞疫苗发展到基因工程化疫苗以及肿瘤特异性多肽疫苗等，但由于多种因素造成肿瘤局部微环境的深度免疫抑制状态使得肿瘤疫苗的抗肿瘤效应仍不尽人意。超抗原借助于抗肿瘤单抗的特异导向作用而定位于肿瘤局部激活大量T细胞，释放大量细胞因子来杀伤肿瘤。但一般肿瘤细胞抗原性弱且异质性大，一种单抗与超抗原的融合蛋白缺乏抗瘤的广谱性，故这种融合蛋白在实际应用中必然有很大的局限性。本研究用人大肠癌相关抗原C215的基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞系制备成瘤苗，研究了C215Fab-SEA与瘤苗共同激发的对不表达C215抗原的野生型B16黑色素瘤的抑制效应，旨在为恶性肿瘤的免疫生物治疗探索新思路。C57BL/6小鼠皮下接种105B16细胞，随机分为4组，荷瘤第10天起分别给予PBS，106B16-C215瘤苗，C215Fab-SEA 15mg/animal，联合治疗。结果发现，第24天时，联合组的小鼠平均瘤径明显低于对照组以及单用瘤苗、单用融合蛋白C215Fab-SEA治疗组。表明融合蛋白与转染C215基因的瘤苗共同注射于瘤体内，能激发较强的抗肿瘤免疫效应。融合蛋白C215Fab-SEA定位于C215抗原阳性的瘤苗表面，利用SEA对所有携带特殊TCR Vb片段的T淋巴细胞的激活作用，在肿瘤局部释放大量的细胞因子，发挥旁观者效应（bystander effect），同时也可活化NK细胞和单核细胞，促使其分泌细胞因子，通过直接或间接的作用对不表达C215抗原的亲本肿瘤细胞也产生较强的杀伤效应。 我们同时研究了转染IL-18基因并结合C215Fab-SEA的瘤苗对肿瘤攻击的免疫保护作用。B16-C215细胞在体外经IL-18基因转染，并结合上C215Fab-SEA后制备成瘤苗后免疫C57BL/6小鼠（106），一周1次´3，免疫结束后一周分别用B16-215，B16，EL4（无关细胞对照）攻击，观察肿瘤生长情况。结果表明，瘤苗免疫的小鼠对B16-C215和野生型B16细胞的攻击具有明显保护作用，与对照组相比，肿瘤生长均明显减缓，有40%的小鼠未见有肿瘤生长，瘤苗免疫对无关瘤细胞EL4攻击没有保护作用。取各组小鼠的腹股沟淋巴结进行CD4+ ，CD8+亚群分析，发现经过免疫并被B16-215，B16攻击的小鼠腹股沟淋巴结内CD4+ ，CD8+细胞明显增加，而且这两组小鼠脾脏淋巴细胞可被诱导出很强的CTL活性。以上结果提示转染IL-18基因并结合C215Fab-SEA的瘤苗对肿瘤的攻击具有较强的保护作用，刺激引流区淋巴结CD4+，CD8+ T细胞亚群的扩增来发挥抗瘤作用，可有效地诱导出针对B16-C215和野生型B16的特异性免疫反应，有可能作为一种有效的瘤苗用于肿瘤复发和微转移的治疗。 结论： 1． 腺病毒载体介导IL-18的基因治疗联合C215Fab-SEA免疫治疗比单独应用AdIL-18或C215Fab-SEA具有更强大的抗肿瘤作用，可有效激发机体的非特异性和特异性抗肿瘤免疫，刺激淋巴细胞的增殖，增强肿瘤细胞的免疫原性。CD4+ ，CD8+ T细胞亚群都被活化发挥抗瘤作用，Th1型细胞因子IL-2和IFN-g在C215Fab-SEA联合IL-18基因治疗中起着重要作用，Th2型细胞因子则对其作用的发挥起着负向调控。 2． 应用C215Fab-SEA免疫治疗的同时联合腺病毒介导的Lptn基因疗法能增加肿瘤区炎性细胞的浸润，显著激发起机体的特异性抗肿瘤免疫应答以及非特异性的杀伤作用，有效地提高Fab-SEA融合蛋白的抗肿瘤效应。 3． 融合蛋白C215Fab-SEA与转染C215基因的瘤苗共同应用能激发较强的抗肿瘤作用，对不表达C215抗原的亲本肿瘤细胞也产生较强的杀伤效应，控制肿瘤的生长。 4． 转染IL-18基因并结合C215Fab-SEA的瘤苗能有效刺激CD4+，CD8+ T淋巴细胞的增殖，诱导特异性抗肿瘤反应，对肿瘤的攻击具有较强的免疫保护作用，有可能作为一种有效的瘤苗用于肿瘤复发和微转移的治疗。 |