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胃癌与免疫-淋巴细胞过继免疫 当人们发现T淋巴细胞有杀伤肿瘤细胞之后，曾致力于被动输入淋巴细胞，但是输入一般胸腺细胞，效果不甚明确，自1976年以来，开始用淋巴因子，特别是用白介素刺激淋巴细胞增生以来，有很大发展。 LAK细胞 休 闲 居编 辑 LAK细胞是淋巴因子激活杀伤细胞（lymphokine acitvated killer）的简称，1976年，morgan发现丝裂原刺激的淋巴细胞培养上清液中存在一种因子，它能够选择性地维持T淋巴细胞在体外长期培养，人们将它称为T细胞生长因子，1979年统一将白细胞之间相互作用的因子统称为白细胞介素（Interleukin ,IL） ，对T淋巴细胞生长因子称为白细胞介素-2，继而有人（Yrom 及Rosenberg,1980）证明人外周血淋巴细胞经IL-2培养后，诱导出一种具有抗肿瘤高活性的杀伤细胞，后来称为淋巴因子激活的杀伤细胞，即LAK细胞。 LAK细胞的特点：LAK细胞不需抗原刺激，就能杀伤NK细胞所不能杀伤的肿瘤细胞，杀伤作用不受MHC限制，它可杀伤同基因型，同种异体，甚至异种异体瘤细胞，LAK细胞的类型不一，人外周血淋巴细胞中的LAK细胞的前体细胞表达有NK细胞的标志，有Leu19及Leu11（CD16）的标志，但是没有T细胞的标志，它和NK细胞相似，又不同于NK细胞，可能来源于另一细胞郡。 LAK细胞的抗癌效果：IL-2及淋巴细胞单独时杀伤瘤细胞，治疗肿瘤的效果很差。 IL-2/LAK细胞疗法存在 的问题，①副作用明显，常见的复作用是毛细血管渗漏综合征（Gapillary leak syndrome），主要表现为全身性水肿及多脏器功能失调 ，严重者可致胸，腹腔积液，肺间质水肿，呼吸紧迫综合征及充血性心力衰竭，发热是病人常见的现象，②是来源困难，LAK细胞需要量大 ，最好在109以上，因此用外周血淋巴细胞经过培养达到这种数量有一定困难，此外，IL-2需要量也大。 其它LAK细胞：除IL-2产生LAK细胞外，另有许多产生LAK细胞的方法，现介绍主要的两种。 CD3/LAK细胞，T细胞表面有CD3分子，与T细胞受体组成CD3-T细胞受体复合物，因此CD3的单克隆抗体对T细胞有强丝裂原作用，单独使用CD3抗体，对淋巴细胞激活力量小，但用少量抗体 （腹水1份）与效应细胞悬液（500份），外加微量IL-2（30单位/ml）进行培养时，第二天淋巴细胞开始增殖，到第2～3周，可增殖到5×104倍以上，加CD3抗体培养的LAK细胞，大部分为T细胞，而且具有非MHC限制的细胞毒性，CD3/LAK细胞比单纯IL-2/LAK细胞的细胞毒性高6～23倍。 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF），单独使用不能诱导LAK细胞，但在IL-2以外加TNF，可增强LAK细胞的活性。 抗肿瘤单克隆抗体，与IL-2一起培养单个核细胞，也可增强LAK细胞杀伤该肿瘤细胞的活性。 抗胃LAK细胞的制备 单个核细胞的分离，取外周血，加肝素抗凝（50单位/ml血），加等量培养液1640混合后加在Fiooll分离液分层液面上离心20分钟（2000转/分），取中、上层交界处的白色云雾状狭窄带，即单个核细胞层，经1640洗涤后制成细胞悬液。 用含10%小牛血清液及青霉素的培养液中加IL-2300单位/ml，制备IL-2/LAK细胞，加入1：500的CD3腹水及IL-230单位/ml，制备CD/LAK细胞。 LAK细胞的扩增，至 第二周末IL-2/LAK细胞增长约20倍，CD3/LAK增长130倍。 抗胃癌LAK细胞的应用效果 用IL-2/LAK细胞，以胃癌细胞系靶细胞，进行细胞毒试验，以噻唑 兰（MTT）为损伤 的批示剂可见它在适应浓度时，对肿瘤细胞有40%的杀伤作用，而CD3/LAK可有60%的杀伤率，将胃癌细胞接种裸鼠皮下，第1周可长出瘤结节，用IL-2/LAK细胞及CD3/LAK细胞进行治疗，CK3/LAK细胞抑制肿瘤生长的效果，第6周才开始长出瘤结节（白云飞等，1992），临床上使用LAK细胞对胃癌术后的转移有一定抑制作用（田志刚等，1987）。 TIL细胞 TIL细胞为肿瘤浸润细胞（ Tumor infiltrating lymphayte, TIL）是继LAK细胞之后，第二代抗肿瘤淋巴细胞。 TIL细胞的历史：早在1922年就有人提出肿瘤浸润淋巴细胞的概念，但在早期的研究着重从组织学看淋巴细胞浸润的多少以及与癌的分型和预后的关系，继而用机械的办法进行分离，1975年单克隆抗体技术问世以来，对淋巴细胞的亚型分析，使人们对这些细胞的亚型，如是B细胞还是T细胞，是T辅助细胞还是抑制细胞，有了进一步的认识，后来Rosenberg有胶原酶消化的方法替代机械分离，在IL-2的帮助下，TIL细胞对体外肿瘤细胞的杀伤，在体内对有些肿瘤的治疗都取得了肯定的效果，较LAK细胞的疗效高出50～100倍。 TIL细胞的一般情况和疗效：目前已建立了一套TIL细胞的 分离、提出和培养的方法，在体外实验，动物实验及病人体内应用，均取得了良好的效果，当前已证明在黑色素瘤、肾细胞癌、肉瘤和腺癌、鳞状细胞癌、肺癌等实体瘤中，TIL细胞可成千倍的扩增，而且在动物实验以及病人应用时，都证明有一定效果，初步展示了TIL细胞的特殊抗癌活性。 胃癌TIL细胞的制备及应用 ①胃癌TIL细胞的分离与培养： 取新鲜胃癌手术标本，除去坏死组织，切碎，用Hank氏液洗去血液，再加入含0.1%的胶原酶、 0.002%DNA酶、0.01%透明质酸酶及抗菌素的1640培养液，在室温下搅拌过夜。,经200目钢网过滤,去除未消化的组织块,再用Hank氏液或1640洗两次，,制成2×106/ml左右的细胞悬液进行梯度密度离心潮(2000转/分)20分钟,吸取75%与100%分离液面之间的白色云雾层,富含TIL细胞,用Hank氏液洗涤,离心,末次离心后,用0.2%台盼兰染色计数活细胞,最后用24孔板培养。 培养时，培养液应含10%人血清、青霉素、链霉素、两性霉素，Hepes缓冲剂及L-谷氨酰胺，培养液中还需加1000单位/ml的IL-2，培养2～3周。 ②TIL细胞体外及体内杀伤瘤细胞的实验： 以胃癌细胞系SGC-7901为靶细胞，经过复苏及培养后，将其 调成1×105/ml 细胞数,加入96孔板中,每孔100μl,再加入 不同浓度的效应细胞,与靶细胞构成不同的比例,以MTT作为杀伤程度的指标,培养液中加过不同浓度的IL-2,在第14天,TIL细胞对胃癌细胞的杀伤作用达到最高水平,而不加IL-2者,不出现杀伤,TIL细胞对胃癌细胞的杀伤率一般为35%～50%。TIL细胞的优点和存在的问题： TIL细胞的优点很多：①可直接从病人活何检标本，肿瘤引流的淋巴结以及 胸腹水中提出，从而避免了由病人外周血制备，因此更适合体质虚弱的病人；②TIL细胞可长期扩增，增殖力超过LAK细胞，容易达到治疗所需的细胞数量；③TIL细胞特异性及抗癌活性高，不损害其它正常细胞；④对IL-2依赖性低，免于使用大量IL-2带来的副作用；⑤大剂量使用时，一般可以耐受，很少毒副作用；⑥配合化疗，可增强TIL细胞的体内疗效，上术优点均为LAK细胞所不及。 TIL细胞只能应用同系动物或自体的淋巴细胞。制备步骤复杂，有待进一步改进，与其它淋巴因子的关系以及在体内杀伤瘤细胞的机制尚待进一步研究。 总之，TIL细胞目前不失为一种有效的治疗肿瘤的措施之一，临床疗效，特别在胃癌方面的疗效需要进一步扩大验证。 |